微生物学におけるグラム染色手順
科学/ゲッティイメージズ
グラム染色は、割り当てるために使用される染色の差別的な方法です バクテリア の特性に基づいて、2 つのグループ (グラム陽性およびグラム陰性) のいずれかに 彼らの細胞壁 .グラム染色またはグラム法とも呼ばれます。この手順は、この技術を開発したデンマークの細菌学者、ハンス・クリスチャン・グラムにちなんで名付けられました。
グラム染色のしくみ
この手順は、一部の細菌の細胞壁におけるペプチドグリカン間の反応に基づいています。グラム染色では、細菌を染色し、媒染剤で色を固定し、細胞を脱色し、対比染色を適用します。
- 一次染色 ( クリスタルバイオレット ) ペプチドグリカンに結合し、細胞を紫色に着色します。グラム陽性細胞もグラム陰性細胞も細胞壁にペプチドグリカンを持っているため、最初はすべての細菌が紫色に染まります。
- グラムのヨウ素 ( ヨウ素 およびヨウ化カリウム) は、媒染剤または固定剤として適用されます。グラム陽性細胞はクリスタルバイオレット-ヨウ素複合体を形成します。
- アルコール またはアセトンを使用して細胞を脱色します。グラム陰性菌は細胞壁に含まれるペプチドグリカンがはるかに少ないため、このステップで実質的に無色になりますが、ペプチドグリカンが多いグラム陽性細胞 (細胞壁の 60 ～ 90%) からは一部の色のみが除去されます。グラム陽性細胞の厚い細胞壁は、脱色ステップによって脱水され、収縮を引き起こし、内部にヨウ素染色複合体を閉じ込めます。
- 脱色ステップの後、細菌をピンク色に着色するために対比染色（通常はサフラニン、時にはフクシン）が適用されます。グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方がピンク色の染みを拾いますが、グラム陽性菌の濃い紫色の上には見えません.染色手順が正しく実行されると、グラム陽性菌は紫色になり、グラム陰性菌はピンク色になります。
グラム染色法の目的
グラム染色の結果が表示されます 光学顕微鏡を使用して .細菌は着色されているため、グラム染色グループが識別されるだけでなく、 彼らの形 、サイズ、および凝集パターンが観察される場合があります。これにより、グラム染色は診療所や研究室にとって貴重な診断ツールとなります。染色によって細菌を確実に特定できるわけではありませんが、多くの場合、細菌がグラム陽性かグラム陰性かがわかれば、効果的な抗生物質を処方するのに十分です。
技術の制限
一部の細菌は、グラム可変またはグラム不確定である可能性があります。ただし、この情報でさえ、細菌のアイデンティティを絞り込むのに役立つ場合があります。この手法は、培養後 24 時間未満の場合に最も信頼性が高くなります。ブロス培養にも使用できますが、最初に遠心分離することをお勧めします.この手法の主な制限は、手法でミスを犯した場合に誤った結果が生じることです。信頼できる結果を生み出すには、練習とスキルが必要です。また、感染因子は細菌ではない場合があります。真核病原体はグラム陰性に染色されます。ただし、ほとんどの 真核細胞 菌類 (酵母を含む) を除いて、プロセス中にスライドに付着しません。
グラム染色手順
材料
- クリスタルバイオレット（一次染色）
- グラムヨウ素（媒染剤、クリスタルバイオレットを細胞壁に固定するため）
- エタノールまたはアセトン（脱色剤）
- サフラニン (二次染色または対比染色)
- スプレーボトルまたはスポイトボトルに入った水
- 顕微鏡スライド
- 複合顕微鏡
手順
- スライド上に細菌サンプルを一滴垂らします。ブンゼン バーナーの炎を 3 回通過させてスライドにバクテリアを熱固定します。加熱しすぎたり長時間加熱したりすると、バクテリアの細胞壁が溶けて形が崩れ、結果が不正確になる可能性があります。加熱が少なすぎると、染色中にバクテリアがスライドから洗い流されてしまいます。
- スポイトを使用して、スライドに一次染色 (クリスタル バイオレット) を適用し、1 分間放置します。スライドを水で 5 秒以内でやさしくすすぎ、余分な汚れを取り除きます。すすぎが長すぎると脱色しすぎる可能性がありますが、すすぎが不十分であるとグラム陰性細胞に染色が残りすぎる可能性があります。
- スポイトを使用してスライドにグラムヨウ素を塗布し、クリスタル バイオレットを細胞壁に固定します。 1分間放置します。
- スライドをアルコールまたはアセトンで約 3 秒間すすぎ、その後すぐに水で軽くすすぎます。グラム陰性細胞は色を失いますが、グラム陽性細胞は紫または青のままです。ただし、脱色剤を長時間オンにしておくと、すべての細胞が色あせてしまいます。
- 二次染色、サフラニンを適用し、1 分間放置します。水で5秒以上やさしく洗い流してください。グラム陰性細胞は赤またはピンクに染色されるはずですが、グラム陽性細胞は依然として紫または青に見えます。
- 複合顕微鏡を使用してスライドを表示します。細胞の形状と配置を区別するには、500 倍から 1000 倍の倍率が必要になる場合があります。
グラム陽性およびグラム陰性の病原体の例
グラム染色で特定されたすべての細菌が病気に関連しているわけではありませんが、いくつかの重要な例は次のとおりです。